Para refletir...

O CASO DE NATHANIEL WU

E depois do Genoma...Proteoma

   Com a conclusão do projeto genoma alguns pesquisadores se voltaram para outro desafio, a identificação de genes e o sequenciamento de proteínas. Uma pesquisa está diretamente ligada à outra, pois são as proteínas, como a hemoglobina e a insulina, que carregam as mensagems dos genes para controlar as funções do organismo. O trabalho é grande, pois cada um dos 30 mil genes pode produzir vários tipos de proteína. É o que os cientistas chamam de flexibilidade genética, característica de seres complexos como o homem.

O que define as propriedades do organismo não é exclusivamente o DNA, são as proteínas codificadas por ele. O processo é semelhante ao sequenciamento de genes: no genoma, os cientistas identificam a ordem das bases nitrogenadas A, C, G e T (que somam 3,1 bilhões de pares); no proteoma, estuda-se a combinação dos 20 tipos de aminoácidos, que podem assumir milhares de combinações. Uma vez definida a estrutura da proteína, é possível determinar sua função no organismo. A nova era que se inicia é a do proteoma.

O segredo para a complexidade do homem, portanto, não está no número de genes - igual ao do milho e pouco maior que o de um verme, por exemplo -, mas na capacidade de produzir uma diversidade maior de proteínas. O genoma humano servirá de trampolim para acelerar as pesquisas do proteoma, que ainda estão em estágio inicial.

Primeiro, no entanto, será preciso identificar onde começa e termina cada gene - um trabalho que poderá levar décadas. Apenas 1% de todo o código genético codifica proteínas. O grande desafio é distinguir os genes e suas funções. Os cientistas já isolaram 15 mil genes humanos, mas apenas 7 mil têm função conhecida.

A bactéria T. aquaticus e a Taq DNA polimerase

Arqueobactérias termófilas vivem em
ambientes com altíssimas temperaturas.

   A bactéria Thermus aquaticus é uma arqueobactéria termófila que possui grande importância para a biotecnologia.

   A DNA polimerase foi isolada em 1976, porém, poderia ser isolada na forma mais pura. Mais tarde, descobriu-se que teria grande uso em PCR, para amplificar pequenos segmentos de DNA. Antes da descoberta do DNA Taq, que provém da T. aquaticus, eram necessárias enzimas para serem adicionadas depois de cada ciclo de desnaturação do DNA, mas com o uso da Taq DNA polimerase não era mais necessário. A Taq polimerase tem uma atividade ótima em 72-80 graus Celsius e uma vida média de nove minutos, com 97,5°C, pode replicar 9000 pares de base em menos de 10 segundos.

   Esta enzima, assim que descoberta, foi logo clonada, sequenciada, e produzida em grandes quantidades para venda comercial.

O PGH e a Ética

Como todas as grandes descobertas científicas, o Projeto Genoma Humano, apesar da sua incontestável importância no campo de cura a denças genéticas, pode ser utilizado para fins pouco nobres.

A informação sobre os genes de um indivíduo poderia ser consultada, por exemplo, por potenciais empregadores, que queiram decidir quem contratar ou por seguradoras, para avaliar o histórico de uma pessoa que quer adquirir um seguro de vida. Além ( indo um pouquinho mais longe) de poderem ser também utilizadas pelas Forças Armadas, agências de adoção e escolas, dando lugar à discriminação genética, como se não bastasse os tantos tipos de discriminação já existentes.

 

 

Outra polêmica a ser considerada seria o melhoramento genético humano. Da mesma forma que as técnicas de terapia genética já são utilizadas na agricultura e na pecuária, por exemplo, para se obter vacas que dêem mais leite ou frutas de um tamanho e qualidade melhores, elas poderiam ser utilizadas para gerar indivíduos mais altos ou mais agressivos. Seriam "Projetos de Seres Humanos".

 

Por outro lado, não poderíamos olhar este tema sem ver seu lado positivo, que ainda sobressai a futuros eventuais problemas: Para algumas doenças, como a hipertensão ou a obesidade, as respostas do organismo ao ambiente que o cerca são decisivas. Para outras, no entanto, o componente genético é fundamental, e encontrá-lo constitui o primeiro passo para a sua cura. A terapia genética é a utilização direta do DNA, como um substituto para a cura de doenças hereditárias e adquiridas. Desde o seu começo, na década de 80 progrediu lentamente principalmente porque cada tipo de doença requer um tratamento particular. E além disso, é necessário superar várias etapas até se chegar à aplicação em pacientes. Atualmente as doenças mais investigadas são os diferentes tipos de câncer e a Aids, que ainda aterrorizam a raça humana.

 

Portanto, este novo método de tratamento de doenças genéticas (Genoma Humano) tem, que antes de tudo, deixar de ser motivo de rivalidade e cobiça de laboratórios e passar a ser um "Talvez" na melhoria ou não do futuro da humanidade.

Os benefícios do Projeto Genoma

As informações detalhadas sobre o DNA e o mapeamento genético dos organismos estão revolucionando  as explorações biológicas desde o início do Projeto Genoma, não só o humano. Na Medicina, por exemplo, o conhecimento sobre como os genes contribuem para a formação de doenças que envolvem um fator genético - como o câncer, por exemplo - tem levado a uma mudança da prática médica. Estamos entrando em uma nova fase, a da prevenção ao invés do tratamento de doenças hereditárias. Novas tecnologias clínicas estão surgindo, baseadas em diagnósticos de DNA; novas terapias baseadas em novas classes de remédios; novas técnicas imunoterápicas; prevenção em maior grau de doenças pelo conhecimento das condições ambientais que podem desencadeá-las; possível substituição de genes defeituosos através da terapia genética; produção de drogas medicinais por organismos geneticamente alterados.

O conhecimento da genética humana auxilia muito o conhecimento da biologia de outros animais, uma vez que esta não é muito diferente da biologia humana, permitindo também seu aperfeiçoamento e tornando os animais domésticos, por exemplo, mais resistentes à doenças.

As tecnologias, os recursos biológicos e os bancos de dados gerados pela pesquisa sobre o genoma promovem grande impacto nas indústrias relacionadas à biotecnologia, como a agricultura, a produção de energia, o controle do lixo, a despoluição ambiental.

Mas nem tudo é um mar de rosas...

PCR: Reação em Cadeia pela Polimerase.

   Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califórnia, recebeu o prêmio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre muitas outras para além da Investigação em Biologia. A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reação em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo.

   OS PASSOS DA PCR

   A PCR está desenhada de acordo com o princípio natural de replicação do DNA. Este é um processo que decorre em três passos, que em conjunto se designam como um ciclo e que se repete um número específico de vezes. Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleotídeos iniciadores, os quatro desoxinucleotídeos constituintes do DNA e o cofator Mg²⁺. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação.

   Assim, um ciclo de PCR consiste nos seguintes passos:

1. Desnaturação

2. Hibridização

3. Extensão

   Este processo tem lugar num termociclador, um equipamento que automaticamente controla e alterna as temperaturas durante períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR (geralmente entre 30 e 40 ciclos).

1. DESNATURAÇÃO TÉRMICA

   A temperatura elevada (geralmente > 90ºC) separa a cadeia dupla de DNA em dois filamentos, sendo este processo conhecido como “desnaturação”. Os dois filamentos ou cadeias de DNA são mantidos juntos por ligações de hidrogênio que quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações covalentes que são fortes, permanecem intactas.

2. HIBRIDIZAÇÃO

   O objetivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de DNA, mas apenas replicar a sequência de interesse (normalmente com tamanhos entre 100 e 600 pares de bases) que é única no organismo. 

   Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleotídeos, entre 20 e 30 bases.
   Numa reação de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação. O início da sequência de DNA alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequência  complementar. 

   A temperatura de hibridização normalmente encontra-se entre 40 ºC e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequências iniciadores se liguem à sequência alvo com elevada especificidade.

3. EXTENSÃO

   Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de DNA. 

   A Taq polimerase é uma polimerase de DNA termo-estável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrário de outras polimerases, se mantém ativa a temperaturas elevadas. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleotídeos complementares à sequência alvo e utilizando as bases nitrogenadas em solução. 

   A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direção 5’ para 3’.

   O processo envolvendo estes três passos pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos), sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente. Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de DNA aumentaria 2²⁵ vezes, embora, na prática, devido a alguma ineficiência no processo de amplificação, esse aumento fique por um milhão de vezes.

Aqui também se faz ciência - Parte II: O Genoma do Câncer

Dr. Andrew Simpsom, bioquímico

do Instituto Ludwig

 e coordenador do projeto

Em 1999, a rede ONSA lançou o Projeto Genoma Humano do Câncer (Human Cancer Genome Project - HCGP), área do Genoma Humano de alta competitividade no cenário internacional, com o objetivo inicial de produzir meio milhão de expressed sequence tags (ESTs), de tecido tumoral humano. O Projeto HCGP, uma parceria financeira entre a FAPESP e o Ludwig Institute for Cancer Research (Instituto Ludwig para Pesquisa sobre o Câncer), envolveu o trabalho conjunto de cerca de 29 laboratórios paulistas, por dois anos (http://www.ludwig.org.br/ORESTES/grupos.html).

Tecidos tumorais humanos foram analisados para a identificação de genes expressos na caracterização de ESTs pelo método ORESTES (open reading frame expressed sequence tags). Esta metodologia privilegia a porção central dos genes, pelo uso de oligonucleotídeos (primers) arbitrários, não degenerados, em condições de baixa estringência, em reações de PCR antecedidas de uma reação de transcrição reversa.

MegaBace 1000‰

Aliado a esta metodologia que detecta posições centrais de genes expressos, o sucesso do Projeto deveu-se ao investimento em seqüenciadores de última geração, ainda mais potentes que os utilizados em projetos anteriores no Brasil, os seqüenciadores automáticos multi-capilares, MegaBace 1000‰ (Amersham BioSciences). A utilização deste equipamento, capaz de seqüenciar 96 seqüências em cerca de 3 horas, fez com que o Projeto atingisse em menos de um ano a meta inicial de seqüenciar 500.000 seqüências, sendo então expandida a meta inicial para 1 milhão de seqüências, para o período total do Projeto. Na realidade mais de 1 milhão de ESTs foram seqüenciadas, tendo sido o resultado criteriosamente avaliado pelo Centro de Bioinformática, que além da qualidade técnica do seqüenciamento, baseado no Programa computacional phredPhrap (Washington University), checava possíveis contaminações dos reads de ESTs com seqüências de vetores plasmidiais e de bactérias utilizados no procedimento metodológico.

Somente sequências com padrões de qualidade estabelecida foram computadas para constituir o banco de dados do HCGP (http://www.ludwig.org.br/ ORESTES). Até o momento 823.987 sequências ORESTES do Banco HCGP estão depositados no GenBank – National Center for Biotechnology Information, EUA, sendo acessíveis publicamente no website http://www.ncbi.nlm.nih.gov, busca em <nucleotide>, com a palavra-chave ORESTES.

Animação sobre chips de DNA

No link a seguir, vocês poderão encontrar uma animação que explicará passo a passo a metodologia na utilização do chip de DNA. Vale a pena conferir!

Este é o link! :)

Chips de DNA, a revolução na genética!

   Antes da definição real, é importante compreender que chips de DNA são um avanço significativo, porque eles podem conter um número muito grande de genes e por causa de seu pequeno tamanho. DNA microarrays são, portanto, úteis quando se quer fazer um levantamento de um grande número de genes rapidamente ou quando a amostra a ser estudada é pequena. Os chips podem ser utilizados para a expressão do gene dentro de uma única amostra ou para comparar a expressão gênica em dois tipos de células diferentes, ou amostras de tecido, como em tecidos saudáveis ​​e doentes.

   Chips de DNA também são conhecidos pelos nomes: microarranjos de cDNA, gene chips, biochip, gene array e DNA microarray. DNA microarrays são pequenos suportes sólidos sobre os quais as sequências de milhares de genes diferentes são imobilizadas. O suporte, em si, são lâminas de microscópio de vidro, do tamanho de dois dedos lado a lado, mas também podem ser chips de silício ou membranas de nylon. Trata-se de um microchip contendo milhares de segmentos de DNA imobilizados sobre a lâmina, os quais permitem análises simultâneas de milhares de sequências de cDNA (cópia do DNA, gerada a partir do RNAm) paralelamente através da hibridização.

   Hibridização é o pareamento complementar de um filamento de RNA e um de DNA ou de dois filamentos de DNA diferentes (reassociação). A hibridização é um método que utiliza a tendência natural que uma cadeia simples de DNA tem de se reassociar com sua cadeia complementar para formar a dupla hélice. Desta forma, um determinado fragmento de DNA pode ser localizado em uma mistura heterogênea, desde que se disponha de uma sequência complementar do fragmento, a sonda.

   Ao chip de DNA é adicionado RNAs ou DNAs fluorescentes, que se forem complementares a alguma sequência do chip, irão hibridizar e indicar aonde houve correspondência. Pode-se, portanto, comparar a célula de um pulmão animal sadio com a célula de um pulmão de um animal com asma, por exemplo. Desta forma torna-se possível perceber que no pulmão do animal com asma há uma série de genes que não são observados no pulmão normal. Pode-se concluir que esses genes devem estar relacionados com a patologia estudada.

   Existem duas grandes aplicações para a tecnologia de chips de DNA:

1)     identificação de sequências (gene/mutação de gene);

2)     determinação de nível de expressão (abundância) de genes.

   O uso mais frequente dos microarrays é na determinação da expressão gênica. A alta performance desta técnica é que pode-se determinar a expressão diferencial de milhares de genes num único experimento.

   A deposição dos cDNAs (de 500 a 5000 bases de comprimento) no chip é feita por meio de um robô capaz de imprimir milhares de pontos com diâmetro entre 50 e 100 mícrons. De maneira geral, em uma área de chip com 3,6 cm² podem ser depositadas cerca de 10.000 sequências curtas de cDNAs. Nota-se que cada ponto representará um segmento gênico em particular, portanto, quanto mais pontos no microarray, mais abrangente ele será em sua análise.

   Uma vez produzidos, os chips são hibridizados com sondas de RNAm, preparadas a partir de duas fontes distintas e marcadas com nucleotídeos que fluorescem em comprimentos de onda distintos. Em seguida, as sondas são misturadas e hibridizadas com os DNAs imobilizados no chip. O sinal fluorescente emitido por pontos de hibridização representa a intensidade do cDNA correspondente. A emissão da fluorescência é detectada por um scanner, que faz a varredura de todo o campo de distribuição dos microarranjos, produzindo uma imagem de pontos com diferentes intensidades de luz e cores. A imagem é processada pelo computador acoplado ao scanner, obtendo-se informações quantitativas da expressão gênica nas condições de estresse e controle.

   Resumindo: no “mapa” lido pelo biochip, os genes superexpressos e os fracamente expressos ficam representados em diferentes cores de destaque, enquanto os não diferentemente expressos aparecem numa coloração intermediária.

   Os pontos vermelhos implicam a expressão de um gene específico na amostra n º 1. Pontos verdes implicam a expressão do gene na amostra n º 2, e pontos amarelos implica que o gene é expresso em ambas as amostras.

  

Aqui também se faz ciência - Parte I: O Genoma da Xylella

Causadora da praga do amarelinho, a Xylella foi escolhida pela Fapesp como organismo para seu projeto genoma piloto por uma conjunção de fatores. Para citar os mais importantes: pelo fato de não haver no mundo, à época, outra pesquisa de sequenciamento de um fitopatógeno, sua importância econômica (cerca de 30% dos laranjais paulistas são afetados pelo amarelinho) e o tamanho de seu genoma (2,7 milhões de pares de bases, relativamente pequeno). Prova de que a escolha foi acertada é a fala de Peter Johnson, responsável por um dos maiores programas de financiamento de pesquisa do departamento de Agricultura norte-americano: "Meus caros, tenho para vocês uma boa e uma má notícia. A boa é a de que foi concluído o sequenciamento do primeiro fitopatógeno no mundo. A má é a de que não fomos nós que fizemos, mas um grupo brasileiro".

O reconhecimento da importância da pesquisa veio com a publicação do artigo científico descrevendo os resultados do projeto, na revista Nature, que aliás já havia publicado, em 1997, uma notícia dando conta do início do projeto, com destaque para o ineditismo da pesquisa com a bactéria. A publicação do artigo, como bem sabem os cientistas, é um importante fator de certificação do mérito da pesquisa e certamente fará aumentar as citações internacionais dos pesquisadores envolvidos no projeto e indiretamente da ciência brasileira. Enquanto isso, outros projetos genoma financiados pela Fapesp já estão em andamento.

Como consequência direta do Genoma Xylella, surgiu, em 1999, o Genoma Xylella Funcional, que buscou estudar apenas os genes de caráter patogênico da bactéria, ou seja, aqueles que mantêm relação com a praga do amarelinho. Desta etapa participaram cerca de 20 laboratórios, que no prazo de um ano deveriam apresentar seus primeiros resultados. Eles foram selecionados entre os cerca de 100 que apresentaram propostas à Fapesp. Como exemplo das pesquisas, há o estudo da biossíntese de goma xantana, substância viscosa produzida pela Xylella e uma das possíveis causas do entupimento dos vasos da laranjeira, o que causa o amarelinho.

Outro estudo em curso, utilizando novos métodos de microscopia eletrônica, é o da adesão bacteriana no trato bucal da cigarrinha que transmite a Xylella e sua influência na propagação da doença.

Medicina e Genoma Humano - Diagnóstico genético pré implantacional (PGD)

As descobertas do Projeto Genoma Humano possibilitaram à medicina uma personalização da prática terapêutica, adotada com base no genoma do paciente. A Medicina, antes baseada apenas na anatomia e na fisiologia, entrou numa nova era: a da terapia gênica e da manipulação celular. Com o genoma decodificado, muitas doenças serão evitadas e outras curadas pela manipulação dos genes. O alcance dessas novas possibilidades terapêuticas pode atingir objetivos nunca antes imaginados. Com o avanço das pesquisas torna-se viável, nas próximas décadas, sonhar com a cura de doenças degenerativas, como a esclerose múltipla, o Mal de Parkinson e de doenças da medula espinhal que incapacitam movimentos e prejudicam a qualidade de vida.

O diagnóstico genético pré-implantacional, chamado de PGD é um bom exemplo dos avanços agregados à medicina pelo avanço tecnológico. O exame permite que embriões sejam testados perante uma doença genética antes de sua transferência para o útero materno, ou seja, antes do início da gestação.

Para compreendermos melhor o alcance do exame, é bom fazer uma diferenciação entre doença genética e doença hereditária. Doença genética é todo e qualquer distúrbio que afeta o nosso material genético. Portanto, qualquer doença não infecciosa e não contagiosa que afete o material genético, em maior ou menor escala, é uma doença genética. O câncer, por exemplo, é uma doença genética, assim como a hipertensão, o diabetes e a obesidade.

Já as doenças hereditárias dependem unicamente dos genes para aparecer. São doenças nas quais as causas genéticas não deixam margem a qualquer chance de que a mesma não se manifeste. São doenças que não permitem qualquer manobra de prevenção e são inexoravelmente hereditárias, como a Síndrome de Down, a hemofilia e a polineuropatia amiloidótica familiar.

O PGD

Assim, o PGD – exame realizado em alguns laboratórios de reprodução assistida com o auxilio do LASER – permite separar os embriões portadores de algum tipo de desordem genética, transferindo para o útero materno apenas os embriões saudáveis, beneficiando principalmente casais com alto risco genético, como doenças de etiologia autossômica dominante ou recessiva.

O PGD requer, necessariamente, que a fecundação seja realizada via fertilização in vitro (FIV). Pois é durante o procedimento de ICSI, que é efetuada a biópsia: uma célula embrionária – blastômetro – é removida do embrião no terceiro dia, sem comprometer o seu desenvolvimento, e, em seguida é feita a análise genética.

A constituição cromossômica destes blastômeros pode ser analisada por diferentes testes genéticos, como a hibridização fluorescente in situ (FISH) ou a reação em cadeia da polimerase (PCR). “A PCR permite detectar defeitos genéticos envolvendo um único gene, tais como fibrose cística, anemia falciforme, doença de Tay-Sachs, dentre outros. Já as alterações cromossômicas numéricas e constitucionais podem ser determinadas por meio da FISH, assim como o sexo dos embriões, usando sondas específicas para os diferentes cromossomos.

Aos poucos, o PGD vem se tornando parte dos programas de FIV, visto que aproximadamente 50% dos embriões podem apresentar alterações cromossômicas e 60% dos abortos de primeiro trimestre podem estar relacionados com essas alterações. Com a identificação e separação dos embriões geneticamente normais, o índice de sucesso de uma gestação aumenta significativamente.

Outra aplicação do PGD está relacionada com a idade materna avançada, comum entre as pacientes que procuram as clínicas de reprodução assistida. Estas pacientes, normalmente demonstram insegurança quanto ao risco de malformações fetais, cuja incidência é diretamente proporcional à idade materna. Como o PGD permite a determinação do sexo de cada embrião, pode-se prevenir também as moléstias relacionadas ao cromossomo sexual, como a hemofilia e a síndrome do X-frágil.

Indicações do PGD: 

• casos de doença com padrão de herança ligada ao sexo;
• situações nas quais o incremento do risco de produção de embriões com desequilíbrio cromossômico numérico ou estrutural está claramente documentado: portadores de alterações cromossômicas numéricas ou estruturais e idade materna avançada;
• abortos de repetição (AR) em casais com cariotipo normal;
• pacientes com falhas repetidas de implantação.

EI! Mas o que é Genoma?

Genoma é todo o DNA de um organismo, incluindo os seus genes. Os genes carregam a informação para a formação de todas as proteínas necessárias por cada organismo. Estas proteínas determinam, entre outras coisas, como o organismo se parece, como o seu corpo metaboliza alimentos ou luta contra infecções, e às vezes até como se comporta.
O DNA é composto de quatro produtos químicos similares, chamados de bases nitrogenadas (Adenina, Timina, Citosina e Guanina) que se repetem milhões ou bilhões de vezes ao longo de um genoma. O genoma humano, por exemplo, tem 3 bilhões de pares de bases, como já citado em postagens anteriores.

A ordem particular de As, Ts, Cs, Gs e é extremamente importante. Essa ordem está por trás de toda a diversidade da vida, ditando se um organismo é humano ou de outra espécie, tais como levedura, arroz ou mosca da fruta e todos têm seu próprio genoma. Devido ao fato de todos os organismos se relacionarem através de semelhanças em sequências de DNA, conhecimentos adquiridos a partir de genomas não-humanos frequentemente levam a novos conhecimentos sobre a biologia humana.

Agora sim! Ou não.

Projeto Genoma Humano - Histórico

As primeiras discussões sobre o Projeto Genoma Humano (PGH) remontam à década de 1980 quando o Departamento de Energia dos EUA promoveu um workshop para avaliar os métodos disponíveis para detecção de mutações durante o qual divulgou a idéia de mapear o genoma humano. 

Em 1990, com iniciativa do Departamento de Energia dos Estados Unidos da América, foi iniciado o Projeto Genoma Humano. Com um financiamento inicial de 3 bilhões de dólares e uma duração prevista de 15 anos, o Projeto Genoma teve como objetivos criar mapas físicos de alta resolução, sequenciar todo o DNA do genoma humano, criar e depositar as informações obtidas em um banco de dados e aperfeiçoar as técnicas moleculares de modo a melhorar a qualidade do estudo.

O Projeto contou com o envolvimento de diversos laboratórios e centros de pesquisa ao redor do mundo, criando dessa forma o Consórcio Internacional de Sequenciamento do Genoma Humano.

O mapa físico é um mapa onde se encontra a localização de diversos marcadores genéticos utilizados como referência para se estudar determinadas regiões. Imagine-se um mapa de uma grande capital que mostra a localização de apenas pontos de referência como shoppings e avenidas, enquanto se necessita o endereço de todas as casas da região.

O mapa físico foi concluído em 1995 junto com novas técnicas que permitiram a automatização das técnicas de DNA (Genetics - a conceptual approach), tornando o sequenciamento do DNA em larga escala possível.

Em 1998, liderada pelo cientista Craig Venter, a Celera Genomics entra na corrida pelo genoma, prometendo sequenciar o genoma humano em menos tempo com um financiamento de apenas dois bilhões de dólares, um valor relativamente menor do que o proposto inicialmente pelo Projeto Genoma. O propósito da participação da empresa era fornecer o código decifrado por um determinado preço àqueles associados ao grupo, além de buscar a patente dos genes envolvidos nos principais distúrbios e doenças humanas.

No dia 10 de julho de 1999 foi anunciado o primeiro rascunho do genoma humano. Como a precisão do resultado precisava ser máxima, muita análise e revisão foi feita de modo que cada base no genoma total fosse sequenciada de 10 a 12 vezes.


Logo após a empresa Celera fez o pedido da patente dos 6500 genes que mapeou. Esse pedido de patente gerou problemas de ordem ética, pois isso poderia inviabilizar a produção de medicamentos baseados nesse conhecimento, levando ao presidente americano Bill Clinton declarar que o genoma humano não poderia ser patenteado.
 

Em 2003 o Projeto Genoma Humano foi considerado concluído, sequenciando 94% do Genoma. Os 6% restante são regiões que ainda hoje não se possui meios de serem analisadas. Essas regiões são basicamente os centrômeros e os telômeros dos cromossomos, que representam o centro e as extremidades de um cromossomo, respectivamente. A dificuldade em se analisar essas regiões se deve a grande quantidade de repetições de DNA e regiões de extremo condensamento.

No dia 4 de Setembro de 2007, o grupo de pesquisa do Instituto J. Craig Venter publicou a sequência completa do genoma do próprio pesquisador Craig Venter. A grande revolução nesse novo trabalho é a de que o genoma avaliado corresponde ao genoma diplóide, contendo a informação de cada par de cromossomo herdado de nossos pais, ao contrário da sequência determinada pelo Projeto Genoma que corresponde ao genoma haplóide. Como resultado, descobriu-se que a diferença das sequências genéticas entre dois indivíduos é de 99,5% e não de 99,9% como se imaginava ao fim do Projeto Genoma Humano.

Como é feito o sequenciamento do DNA

   Nesta postagem será explicado o mapeameno físico/posicional, assunto que já foi abordado no artigo anterior.

   Sequenciar o DNA significa delinear a ordem das bases presentes nos genes, lembrando que os genes formam a estrutura dos 23 cromossomos que são analisados no genoma humano.

   1. PICOTANDO O DNA

   Antes de tudo, as longas sequências de DNA são picotadas em pedaços menores para que elas possam ser analisadas. Essa divisão do DNA é feita por enzimas especiais (enzimas de restrição). Alguns desses métodos permitem apenas que os cromossomos sejam cortados individualmente, outros conseguem cortar o genoma inteiro de uma vez.

   2. CLONAGEM

   Os fragmentos de DNA são então colocados em uma solução com bactérias. As bactérias multiplicam o DNA para que os cientistas possam ter mais matéria prima para análise. Essa etapa pode ser realizada também utilizando-se a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR):

· Primeiro ocorre uma desnaturação no DNA, utilizando-se uma temperatura média de 92°C, na qual provocamos o rompimento das pontes de hidrogênio, e a consequente separação da cadeia dupla do DNA;

· Após a abertura, uma sequência de bases iniciadoras que foram introduzidas na reação de PCR se liga de forma complementar na extremidade da fita de DNA. Sem esse artifício a enzima responsável pela replicação, chamada Taq DNA polimerase, não consegue iniciar seu trabalho de formação da cadeia complementar do DNA.

· Dentre as bases que serão usadas na replicação do DNA, há algumas especiais chamadas terminadoras, que têm a propriedade de interromper a ação da enzima de replicação.

   3. MARCAÇÃO COM FLUORESCÊNCIA

   Os fragmentos de DNA clonados são então divididos em quatro soluções. Cada uma das soluções contém substâncias fluorescentes que reconhecem os fragmentos de DNA que terminam com uma determinada letra (A, T, C ou G). Quando a letra é encontrada, o fragmento recebe uma espécie de "etiqueta" fluorescente para que possa ser reconhecido ( verde - A, azul - C, laranja - G e vermelho - T ).

   4. SEPARAÇÃO

   Os fragmentos de DNA "etiquetados" são então ligados a tubos finos cheios de gel. Uma carga elétrica lentamente "puxa" os pedaços de DNA para dentro dos tubos. Os pequenos fragmentos viajam mais rapidamente do que os grandes O processo acaba separando os fragmentos de acordo com o tamanho (eletroforese).

   5. LEITURA

   Finalmente, todos os fragmentos são separados de acordo com o tamanho. Cada fragmento que é colocado na ordem é um par (A-T ou C-G) maior do que o fragmento seguinte. As "etiquetas" fluorescentes no fim de cada fragmento podem então ser lidas por um sistema a laser, que fornece em seguida a sequência genética daquele pedaço de DNA.

Tipos de mapeamento genético

   Na identificação dos genes ao longo dos cromossomos, podemos destacar a utilização de duas grandes abordagens: o mapeamento genético clássico e o mapeamento físico/posicional.

   No mapeamento genético clássico, a frequência de crossing-oversentre loci distintos é utilizada para determinar a distância relativa entre eles. Essa ideia é contrária ao princípio da segregação independente de Gregor Mendel, que postula que os “fatores” (genes) são transmitidos à geração seguinte de forma independente uns dos outros. No entanto, Mendel não tinha conhecimento de que esses “fatores” responsáveis pelas características se localizam em cromossomos, e aqueles muito próximos, ditos ligados, não obedecem ao princípio da segregação independente.

   Já o mapeamento físico/posicional é realizado utilizando uma biblioteca de pequenas sequências nucleotídicas de DNA cuja ordenação nem sempre é conhecida – essas sequências são obtidas após digestão do DNA genômico utilizando enzimas de restrição. A ordenação destes pequenos fragmentos é realizada por análise de sobreposição, após sequenciamento do DNA. Os fragmentos são dispostos linearmente permitindo a criação de um mapa físico com as localizações específicas e a identificação de cromossomos inteiros.
   Ainda podemos citar uma terceira abordagem utilizada para a identificação de genes: o mapeamento funcional. Nesse caso, são utilizados marcadores de sequências expressas, obtidos a partir de clones de cD NA (a purificação do RNAm de um tecido específico, submetido à reação com a enzima transcriptase reversa, permite a síntese de uma seqüência de “DNA complementar”, o cDNA).A hibridação de um conjunto de diferentes DNA's comlementares com o DNA genômico permite a localização das sequências de alguns genes expressos.

O "mapa da mina".O que é mapeamento genético?

    Mapeamento genético é o estudo feito para localizar em que cromossomos estão os genes responsáveis por algumas características do organismo e quais as distâncias entre os genes dentro de um mesmo cromossomo. O mapeamento genético é, sem qualquer sombra de dúvida, um dos desejos perseguidos há longo tempo pelos investigadores moleculares que procuram incessantemente conhecer as causas para as doenças genéticas. Mas as virtudes do mapeamento genético não são restritas à descoberta desta ou daquela doença. Desvendar os segredos do material genético, não só do ser humano, como de qualquer outro grupo, pode culminar no desenvolvimento de novas tecnologias como identificação de pessoas ou produção de remédios, e ainda auxiliar em todas as áreas da biologia. 

Abordaremos alguns desses tópicos nas próximas postagens.

Até breve.