PCR: Reação em Cadeia pela Polimerase.

   Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califórnia, recebeu o prêmio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre muitas outras para além da Investigação em Biologia. A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reação em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo.

   OS PASSOS DA PCR

   A PCR está desenhada de acordo com o princípio natural de replicação do DNA. Este é um processo que decorre em três passos, que em conjunto se designam como um ciclo e que se repete um número específico de vezes. Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleotídeos iniciadores, os quatro desoxinucleotídeos constituintes do DNA e o cofator Mg²⁺. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação.

   Assim, um ciclo de PCR consiste nos seguintes passos:

1. Desnaturação

2. Hibridização

3. Extensão

   Este processo tem lugar num termociclador, um equipamento que automaticamente controla e alterna as temperaturas durante períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR (geralmente entre 30 e 40 ciclos).

1. DESNATURAÇÃO TÉRMICA

   A temperatura elevada (geralmente > 90ºC) separa a cadeia dupla de DNA em dois filamentos, sendo este processo conhecido como “desnaturação”. Os dois filamentos ou cadeias de DNA são mantidos juntos por ligações de hidrogênio que quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações covalentes que são fortes, permanecem intactas.

2. HIBRIDIZAÇÃO

   O objetivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de DNA, mas apenas replicar a sequência de interesse (normalmente com tamanhos entre 100 e 600 pares de bases) que é única no organismo. 

   Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleotídeos, entre 20 e 30 bases.
   Numa reação de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação. O início da sequência de DNA alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequência  complementar. 

   A temperatura de hibridização normalmente encontra-se entre 40 ºC e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequências iniciadores se liguem à sequência alvo com elevada especificidade.

3. EXTENSÃO

   Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de DNA. 

   A Taq polimerase é uma polimerase de DNA termo-estável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrário de outras polimerases, se mantém ativa a temperaturas elevadas. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleotídeos complementares à sequência alvo e utilizando as bases nitrogenadas em solução. 

   A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direção 5’ para 3’.

   O processo envolvendo estes três passos pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos), sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente. Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de DNA aumentaria 2²⁵ vezes, embora, na prática, devido a alguma ineficiência no processo de amplificação, esse aumento fique por um milhão de vezes.