Como é feito o sequenciamento do DNA

   Nesta postagem será explicado o mapeameno físico/posicional, assunto que já foi abordado no artigo anterior.

   Sequenciar o DNA significa delinear a ordem das bases presentes nos genes, lembrando que os genes formam a estrutura dos 23 cromossomos que são analisados no genoma humano.

   1. PICOTANDO O DNA

   Antes de tudo, as longas sequências de DNA são picotadas em pedaços menores para que elas possam ser analisadas. Essa divisão do DNA é feita por enzimas especiais (enzimas de restrição). Alguns desses métodos permitem apenas que os cromossomos sejam cortados individualmente, outros conseguem cortar o genoma inteiro de uma vez.

   2. CLONAGEM

   Os fragmentos de DNA são então colocados em uma solução com bactérias. As bactérias multiplicam o DNA para que os cientistas possam ter mais matéria prima para análise. Essa etapa pode ser realizada também utilizando-se a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR):

· Primeiro ocorre uma desnaturação no DNA, utilizando-se uma temperatura média de 92°C, na qual provocamos o rompimento das pontes de hidrogênio, e a consequente separação da cadeia dupla do DNA;

· Após a abertura, uma sequência de bases iniciadoras que foram introduzidas na reação de PCR se liga de forma complementar na extremidade da fita de DNA. Sem esse artifício a enzima responsável pela replicação, chamada Taq DNA polimerase, não consegue iniciar seu trabalho de formação da cadeia complementar do DNA.

· Dentre as bases que serão usadas na replicação do DNA, há algumas especiais chamadas terminadoras, que têm a propriedade de interromper a ação da enzima de replicação.

   3. MARCAÇÃO COM FLUORESCÊNCIA

   Os fragmentos de DNA clonados são então divididos em quatro soluções. Cada uma das soluções contém substâncias fluorescentes que reconhecem os fragmentos de DNA que terminam com uma determinada letra (A, T, C ou G). Quando a letra é encontrada, o fragmento recebe uma espécie de "etiqueta" fluorescente para que possa ser reconhecido ( verde - A, azul - C, laranja - G e vermelho - T ).

   4. SEPARAÇÃO

   Os fragmentos de DNA "etiquetados" são então ligados a tubos finos cheios de gel. Uma carga elétrica lentamente "puxa" os pedaços de DNA para dentro dos tubos. Os pequenos fragmentos viajam mais rapidamente do que os grandes O processo acaba separando os fragmentos de acordo com o tamanho (eletroforese).

   5. LEITURA

   Finalmente, todos os fragmentos são separados de acordo com o tamanho. Cada fragmento que é colocado na ordem é um par (A-T ou C-G) maior do que o fragmento seguinte. As "etiquetas" fluorescentes no fim de cada fragmento podem então ser lidas por um sistema a laser, que fornece em seguida a sequência genética daquele pedaço de DNA.